《神偷奶爸》一片的導演和製片在選角的時候，很堅持要挑選不但能以聲音搞笑的演員，也要能夠用身體演戲，好讓動畫師參考片中角色的動作和造型。製片約翰柯恩說：「我們特地尋找最好的即興表演喜劇演員，因為他們能夠為全片帶來最自然和即興的演出。」

製作小組早就想到該找誰來替這部電腦動畫喜劇片的主人翁格魯一角配音，那就是演出熱門喜劇影集「辦公室瘋雲」以及賣座鉅片《40處男》、《特務行不行》和《約會喔麥尬》的喜劇演員史提夫卡爾，他之前就曾和製片克里斯梅勒丹德利合作過《荷頓奇遇記》一片。

製片克里斯梅勒丹德利說：「史提夫的聲音很有感情，但是他也很會運用他的聲音搞笑。他不但是個演員、即興演出者，也是一名編劇，所以他每次的表現都令人讚不絕口。和他合作的過程總是充滿驚喜，因為你永遠不知道他接下來會做什麼，但是他不管做什麼，總是會達到最棒的笑果。」

史提夫卡爾對於格魯這角色很有自己的想法，他並不想要讓觀眾聽得出他說話的口音來自哪裡，當他終於設定好一個獨一無二的口音，動畫師就能夠更精準地替這角色設計造型。扮演一個壞蛋並不是吸引史提夫卡爾參與這部電影的原因，他說：「這是一個很溫馨感人的故事，雖然格魯好像是個壞到不行的壞蛋，但是他還是很有人性，他在片中一點一點地露出他善良的一面，這也證明了人是可以改變的，而且這部電影也傳達了一個訊息，那就是永遠不要以貌取人。」

史提夫卡爾對於格魯和維克特互相競爭，想得到世上最邪惡的壞蛋的頭銜也覺得很有趣，他說：「格魯不甘於當老二，這讓他很沮喪，因為他是個完美主義者，如果他要當壞蛋，就要當最壞的壞蛋，他無法忍受有一個人一直把他比下去。」那個人就是格魯的死對頭維克特，他在片中被形容比格魯更年輕、擁有更多先進科技也更有野心，製作小組找來最近崛起的喜劇演員兼編劇傑森席格替這角色配音。

這是傑森席格首次替動畫片配音，他也有機會藉由維克特這角色，發掘他超宅的那一面，他說：「我從來沒做過這種嘗試，所以我不知道我不會和其他配音演員同台表演，我必須一個人在錄音室配音，所以需要很豐富的想像力。為了融入維克特這角色，我挖出我很年輕的時候超宅的一面，雖然我已經不是個宅男了，但我卻再度把我這一面表現出來。」

曾經演過賣座喜劇片《搖滾教室》，並且主演備受青少年歡迎的電視影集《愛卡莉》的偶像少女米蘭達克斯格魯夫，在片中為三姊妹中的老大毛毛配音。身為老大，她很懷疑格魯領養她們的動機，也懷疑他幹的不是好事，於是出於直覺，她非常保護她的兩個妹妹。兩位導演一見到米蘭達克斯格魯夫就知道她是這角色的不二人選。

導演克里斯雷納德說：「這角色不好演，能找到米蘭達替大姊毛毛配音很重要，因為這三姊妹是全片的靈魂，而毛毛身為大姊姊必須保護每個人，甚至包括格魯。米蘭達超會演戲，而且她的聲音帶有剛剛好的威嚴感。」

米蘭達克斯格魯夫則說：「史提夫卡爾是我最喜歡的演員之一，當我知道他要替這部電影的主角配音，我就更確定要參與演出，而且這部電影的故事很好玩，我喜歡主角是個壞蛋，這應該是第一次壞蛋當一部電影的男主角吧，但是格魯後來證明他其實也有善良的一面，我很喜歡這一點，我也很喜歡演三姊妹中的大姊姊，我在片中有很多很機智很搞笑的台詞。」

替老二蒂蒂配音的是黛娜蓋兒，這名正在唸國中的年輕演員說：「這角色又調皮又愛諷刺別人，她是個麻煩製造者，我完全可以認同，因為我和我的姊妹也很會惹麻煩。蒂蒂喜歡亂碰人家叫她不要碰的東西，她是那種怎麼講都不聽的小鬼頭，不過那也代表她充滿了好奇心和探索的精神。」製作小組最後找來年紀最小的愛西費雪替小妹安安配音，導演每次要安安咯咯笑的時候，愛西費雪總是不會讓他們失望，因為她天生就愛笑，而且她也超會拿捏搞笑的時機，每次都會在很嚴肅的時候爆出一句超好笑的笑話。

《神偷奶爸》一片的製作小組覺得最幸運的是能夠請到老牌巨星茱麗安德魯替格魯老媽配音，格魯的老媽總是對格魯嫌東嫌西，覺得他做什麼都做不好，就算他做出什麼很屌的壞事她都一樣嗤之以鼻。

製片克里斯梅勒丹德利說：「當我們邀請茱麗參與這部電影的時候，她的反應是興奮的，但是當她得知她要替格魯老媽配音的時候又有點抗拒，因為這角色和她曾在《真善美》或《歡樂滿人間》飾演的經典角色完全相反，她必須演一個嘴巴很賤的老媽。」

編劇搭檔辛科保羅與肯多利歐想像格魯的老媽應該希望她的兒子做什麼都要做到最好，但是她教兒子的方法卻是打罵教育，製片克里斯梅勒丹德利說：「茱麗一開始的反應並不是她從來沒演過這種角色，而是她從來沒遇過這種人，但是她一開始對這角色的抗拒，很快就變成她想要做與以往完全不同的嘗試的渴望。」

茱麗安德魯則說：「格魯老媽是個很糟糕的媽媽，有時候這角色會讓我覺得很討厭，有時候又會把我逗得笑到不行，但是重要的是，這部電影的主題是愛心，它說的是愛的力量以及小孩子能帶來的歡樂。片中的三姊妹完全不知道有邪惡這種東西，她們只想要被愛。」

史提夫卡爾說：「如果有人最不適合演一個壞媽媽，那就是茱麗安德魯，但是她真的很棒，也許這部電影把她壞的一面給挖了出來。」

替格魯的專屬邪惡科學家奈安內博士配音的是英國諧星羅素布蘭登，替萬惡銀行貸款部經理柏金斯先生配音的，則是也曾替《荷頓奇遇記》配音的威爾阿奈特，他曾為許多電腦動畫片配音，包括《料理鼠王》和《怪獸大戰外星人》。《神偷奶爸》一片中的壞蛋不只有男的，片中最壞的角色也許是哈蒂阿姨，也就是毛毛、蒂蒂和安安住的孤兒院的院長，她不是一不爽就把無辜的孤兒關進「羞羞臉紙箱」，不然就是逼他們到處去賣餅乾替她賺錢。

製作小組找來出身於「週末夜現場」的喜劇女演員克莉絲汀薇格替這角色配音，她說：「我是看動畫片長大的，動畫片是我小時候的一部份，我在『週末夜現場』就經常用不同的聲音飾演不同的角色，所以能夠參與這部電影我真的很興奮。」熱門影集「超級製作人」的演員傑克麥克布瑞爾是唯一替多個角色配音的演員，他說：「我配音的第一個角色是一個講話超大聲，不顧別人的典型美國觀光客，後來又替遊樂園攤位老闆配音，這兩個角色其實都跟我長得一模一樣。」